病理诊断指通过手术切除、内镜活检、细针穿刺等方式获取人体组织或细胞，借助显微镜等工具对样本进行一系列处理和观察，研究疾病病因、发病机制、形态结构、功能和代谢等方面的改变，揭示疾病的发生发展规律，从而阐明疾病本质的医学科学，是绝大部分疾病，尤其是肿瘤疾病的诊断“金标准”。
病理诊断流程主要包含取样、制片、诊断、报告四个步骤。
根据样本类型可分为组织学检查、细胞学检查两类。
二者取样方式并不相同，组织学样本一般通过开放手术、内镜检查或经皮穿刺活检获取，而细胞学样本一般通过体液、拉网、细针穿刺、脱落细胞等途径获取。
组织学检查和细胞学检查是病理诊断的两类基本方式，通常称为组织病理和细胞病理，主要进行的是形态学观察。
通过分别与免疫诊断、分子诊断相结合，病理诊断形成了另外两个重要分支：免疫病理和分子病理，将病理诊断从组织、细胞水平的形态学观察深入到蛋白与分子水平。
一、组织病理
组织学检查一般可分为石蜡切片和术中冰冻切片两种制片方式，二者应用场景不同，各有优劣。
石蜡切片应用最为广泛，但制片过程较为繁琐，耗时较长，一般需要3-5天才能出具结果，但清晰度较高，并且可以长期保存使用；
冰冻切片一般用于手术中快速诊断，通过低温将组织快速冷却硬化，仅需半小时左右即可出具诊断结果，但制片质量不如石蜡切片，存在一定误诊率，对病理医师要求较高。
根据年《病理科建设与管理指南（试行》要求，出具一般病理诊断报告的医师需具备初级以上病理学专业技术职务任职资格，且经过病理诊断专业知识培训或专科进修学习1-3年，而快速病理诊断医师应当具有中级以上病理学专业技术任职资格，并有5年以上病理阅片诊断经历。
HE染色为最常见、最基本的切片染色方法，其中苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
二、细胞病理
目前，细胞病理常用制片技术分为巴氏涂片及液基薄层细胞学制片技术。
巴氏涂片法利用刮板从宫颈处刮取脱落细胞，然后直接在玻片上涂抹，进而完成固定、染色。由于巴氏涂片存在细胞丢失、制片质量差等问题，其逐步被液基薄层细胞学制片方式替代；液基薄层细胞学制片主要可分为膜式制片（TCT）、沉降式制片（LCT/LBP）两类，一般习惯统称为TCT，不做具体区分。
TCT：利用将宫颈脱落细胞洗入细胞保存液瓶中，刮片毛刷在小瓶内搅拌，通过高精密度过滤膜过滤将标本中的杂质分离，取滤后的上皮细胞制成直径为20mm薄层细胞于载玻片上，而后进行固定、染色、封片。
LCT/LBP：采用两次离心及独立染色，在自动化、标准化等方面具有较大优势，可以实现对病理诊断质量的良好控制，目前已成为我国主流细胞学制片方式。除主要应用于宫颈细胞学检测以外，在痰、胸腹水、尿液、肺泡灌洗液等非妇科样本检测方面更具优势。
三、免疫组化病理
免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）指利用抗原与抗体间的特异性结合原理和标记于抗体上的显色剂（酶、荧光素、同位素、金属离子等），对组织内特定抗原或抗体进行定位、定性或定量检测。IHC具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合等特点，有利于病理学领域的深入研究，在现代病理诊断中起重要作用。
相关术语还包括免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）和免疫荧光（Immunofluorescence,IF），IHC、ICC指通过标记酶进行显色，临床上一般统称为IHC，不作严格区分；
IF利用荧光素而非酶来进行显色，有时也称为荧光法IHC。
IF是最早建立的免疫组织学技术。将已知抗体标上荧光素，以此作为探针，检查细胞或组织内的相应抗原。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光，从而对组织中的抗原进行定位或定量，需配合使用荧光显微镜进行观察。
IHC/ICC技术出现在IF之后，目前在临床上应用最为广泛。IHC/ICC先以酶标抗体作用于组织或细胞，然后加入底物，在酶的催化下生成有色的不溶性物质，从而对细胞内抗原进行定位，只需使用普通光学显微镜即可进行观察。
免疫组化在病理诊断工作中应用广泛，可提供蛋白表达层面的客观证据，在肿瘤良恶性判断、确定肿瘤细胞来源、鉴别诊断肿瘤类型或亚型、肿瘤分化方向、肿瘤分级、预后判断、靶向治疗、微小转移灶的发现和确定等方向有广泛应用。
对于感染性疾病，通过免疫组化技术识别特定的细菌、病毒等微生物，提高感染性疾病病理诊断的准确性。
此外，免疫组化还能用于靶向药物肿瘤靶标的测定、肿瘤化学性药物治疗反应的预测以及肿瘤预后判断的综合性评估，达到和实现伴随诊断意义。
免疫组化病理：染色制片过程
1.烤片：将带有蜡的组织切片黏在载玻片上，以免染色过程中切片脱落；
2.脱蜡和水化：通过二甲苯进行脱蜡，然后使用下行梯度乙醇将组织中二甲苯替代出来；
3.抗原修复：部分抗原肽链经过此前步骤处理后发生扭曲，无法在免疫组化染色过程中显示，因而需利用化学试剂或热作用将被封闭抗原重新暴露；
4.细胞膜打孔：使用脂溶性试剂将细胞膜穿孔，增加细胞膜对抗体的渗透性（检测细胞膜抗原时可免去此步骤）；
5.灭活内源性酶及封闭内源性生物素：防止底物H分解，DAB沉淀；
6.非免疫血清封闭：利用与二抗种属相同的非免疫血清封闭电荷，阻止一抗与之结合，抑制非特异性背景着色，防止抗体被组织切片中富有电荷的胶原和结缔组织成分吸附；
7.一抗孵育：按照推荐浓度做梯度稀释，确定最适浓度；
8.二抗孵育：加入选择与一抗种属匹配的二抗进行孵育；
9.显色：滴加显色剂，一般选用DAB或AEC；
10.复染：使用苏木精等普通染料对切片进行复染，使切片清晰显示组织结构，便于准确定位；
11.封片；
免疫组化病理：检测及显色系统
免疫组化染色中使用的抗体主要分为一抗、二抗。
一抗是可与抗原特异性结合的抗体。一抗种类包括单克隆抗体和多克隆抗体，主要作用在于识别出试验所需检测的物质；
二抗可与一抗特异性结合，即抗体的抗体。二抗针对某一特定物种产生的所有抗体均具有特异性，二抗上通常标记酶、荧光基团等物质用于后续显色或发光。二抗的作用在于检测一抗的存在、放大一抗的信号。
根据是否选用二抗以及二抗标记物类型可形成多种不同的检测系统，目前生物素法以及酶标聚合物法使用较为广泛。
显色系统：亦包含多种类型，其中HRP-DAB应用最为广泛。
免疫组化病理：临床应用（以NSCLC为例）
免疫组化技术广泛应用于各类肿瘤的诊断，以非小细胞肺癌（NSCLC）为例，NSCLC占所有肺癌的80%，可以分为不同的组织学类型，主要包括腺癌（≥40%）和鳞癌（30%），以及较为少见的大细胞癌（LCC）（10%）。随着肺腺癌和鳞癌个体化治疗方案的日趋不同，临床强烈要求对不同组织学类型的NSCLC进行明确诊断。
四、分子病理
分子诊断是应用分子生物学方法，通过检测受检个体或其携带病毒、病原体的遗传物质的结构或含量的变化而做出诊断的技术，被广泛应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤伴随诊断等领域。
分子病理则是将分子诊断技术应用于病理诊断中，以组织学/细胞学标本为载体，从基因水平上检测细胞和组织的分子遗传学变化，以协助病理诊断和分型、指导靶向治疗、预测治疗反应及判断预后。
目前分子病理技术路线主要包括聚合酶链式反应（PCR）、荧光原位杂交（FISH）以及高通量测序（NGS），不同技术路线各有优劣，其中PCR与FISH技术平台发展相对较为成熟。
分子病理：技术路线——PCR
聚合酶链式反应（PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
自上世纪80年代问世至今，PCR技术已经迭代至第三代：
第一代定性PCR：通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，分析仅停留在定性或半定量层面，且检测时间长、有交叉感染风险。
第二代qPCR（实时荧光定量PCR）：在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线实现定量分析，数据采集可在PCR扩增过程中完成。
第三代dPCR（数字PCR）：基于芯片式液滴微流控技术，将一个样本分成几万到几百万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，可以对实现绝对定量检测。
分子病理：qPCR技术延伸-突变扩增阻滞系统（ARMS）
ARMS技术：在反应体系内加入针对检测目标的“突变型”引物，利用野生型核酸模板不能与“突变型”引物的3’端碱基互补配对而无法被Taq酶延伸的原理，实现对野生型核酸模板的扩增阻滞。而突变型核酸模板能够与“突变型”引物的3’端碱基互补配对，通过PCR反应放大“突变”信号并最终被qPCR仪检测出来。
利用ARMS技术合并荧光探针，在实时荧光PCR平台上对样本DNA进行一个或多个位点的基因突变检测，是目前应用最成熟、临床应用最广泛的技术平台。该技术优点包括：
（1）检测灵敏度高，可检测肿瘤细胞中突变比例为1%甚至更低的突变基因；
（2）适用于片段化DNA，利于开展分子病理诊断（由于甲醛的固定处理，石蜡包埋标本组织的DNA大部分片段化）；
（3）结合qPCR实现闭管操作，可减少污染的可能性。
分子病理：技术路线——FISH
荧光原位杂交（FISH）是依据碱基互补原理，应用荧光素直接或间接标记的核酸探针，在组织切片、细胞涂片、染色体铺片上检测间期细胞核染色质数量及结构变化，进行定性和相对定量的分析检测技术。由于DNA分子在染色体上沿纵轴呈线性排列，因此可以使用探针直接与染色体进行杂交从而在染色体上定位特定的基因。通过用半抗原标记DNA或RNA探针与目标序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体识别半抗原进行检测，或直接用荧光基团对探针进行标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况。
优点：可多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确；灵敏、特异性好，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变及复杂核型。
缺点：不能达到%杂交，在应用较短的cDNA探针时效率明显下降；对操作和判读技术要求较高；成本昂贵、通量低。
分子病理：技术路线——NGS
高通量测序（NGS）是继Sanger测序的革命性进步，指通过模板DNA分子的化学修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片上，利用碱基互补配对原理，在DNA聚合酶链反应或DNA连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实现碱基序列的解读。
NGS可以进行大规模平行测序，每次运行可同时对数百万个片段进行测序，提高速度和精确度，同时测序成本大幅降低。
来源：医世象
免责声明
★我们尊重原创！本平台部分文章、图片来源或改编自互联网及其他公众平台，主要目的在于分享信息，让更多人获得健康资讯，版权归原作者所有，内容仅供读者参考，如有侵犯您的权益或版权请及时告知我们，我们将尽快删除！
如果您觉得本文不错，请别忘了动动手指点击右上角分享到您的朋友圈！也可以在文末点一点“在看”，和更多朋友分享你的观点哟～
欢迎向我们投稿或推荐优秀文章，将优秀文章与更多的同行分享、交流。
联系张先生（